در مقاله‌ای که به تازگی در نشریه Analytica Chimica Acta به چاپ رسیده است، محققان اثربخشی زیست حسگر CASCADE (تشخیص اسید نوکلئیک رنگ‌سنجی مبتنی بر CRISPR/CAS) خود را بررسی کردند. این حسگر امکان تشخیص اسید ریبونوکلئیک (RNA) ویروس کرونا را با چشم غیر با کمک نانوذرات طلا (AuNPs) فراهم می‌کند.
واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس (RT-qPCR) استاندارد طلایی برای تشخیص ویروس کرونا است. با این حال، این روش گران بوده و حساسیت بالایی ندارد، بنابراین برای تشخیص سریع نقطه مراقبت (PoC) نامناسب است. تست‌های PoC رایج مانند تست‌های آنتی ژن و سنجش‌های سرولوژیکی به ترتیب قابلیت اطمینان پایین و مدت زمان طولانی دارند. بنابراین، نیاز به روش‌های تشخیصی دقیق، سریع و اقتصادی PoC برای تشخیص ویروس کرونا احساس می‌شود. اگرچه روش AuNPs -CRISPR برای تشخیص ویروس کرونا امیدوارکننده است، اما به طور گسترده مورد بررسی قرار نگرفته است.
حسگر CASCADE از پروتئین نوکلئاز Cas CSIPR تشکیل شده است. نانوذرات طلا با توالی‌های الیگونوکلئوتیدی RNA تک رشته‌ای (ssRNA) پوشیده شده‌اند. نوکلئاز Cas با ریبونوکلئوپروتئین (RNP) و RNA راهنما (crRNA) تشکیل کمپلکس می‌دهد که مکمل اسید نوکلئیک هدف است. تعامل crRNA-هدف، آنزیم Cas13 را فعال می کند. با تشخیص هدف، تخریب ssRNA توسط آنزیم نوکلئاز Cas فعال شده انجام می‌شود و در ادامه تجمع نانوذرات طلا صورت می‌گیرد. این فرآیند منجر به کاهش شدت جذب و تغییر رنگ به طول موج های بالاتر شده که قابل مشاهده برای چشم است. این تغییرات تشخیص RNA ویروس کرونا را تسهیل می‌کند.
در مطالعه حاضر، محققان حسگر زیستی CASCADE را برای تشخیص با چشم غیر مسلح RNA ویروس کرونا استخراج شده از سواب فرد آلوده با استفاده از AuNPs طراحی کردند.
پروتئین Cas دو نوع است، Cas12 و Cas13. فعالیت برشی Cas13 چندگانه است و بنابراین، سیگنال‌ها را می‌توان با استفاده از بسیاری از الیگونوکلئوتیدهای غیر اختصاصی تقویت کرد. علاوه بر این، Cas13 به دنباله موتیف مجاور پروتوسپیسر (PAM) نیاز ندارد. استفاده از نوکلئاز Cas13 تطبیق پذیری حسگر را افزایش داد.
این تیم نانوذرات طلا با سه قطر ۳۴، ۲۲ و ۱۲ نانومتر را سنتز کردند و آنها را با الیگونوکلئوتیدهای RNA3 برای شناسایی اهداف ژن SARS-CoV-2-ORF1ab و سنبله (S) پوشاندند. نانوذرات طلا ۱۲ نانومتری سریع‌ترین تشخیص هدف را با تغییرات رنگ شدید در عرض ۱۵ دقیقه ایجاد کرد و بنابراین برای حسگر انتخاب شد.
طول و مقدار پوشش ssRNA روی نانوذرات طلا برای ارزیابی پایداری نانوذرات طلا بررسی شد. هرچه طول ssRNA بیشتر باشد، نانوذرات طلا پایدارتر شده و تجزیه آنزیمی کارآمدتر Cas13 را در پی خواهد داشت. بنابراین، سه طول توالی RNA مورد بررسی قرار گرفت: ۳۳، ۲۳، و ۱۳ nt. از این میان، RNA با طول ۳۳ nt قوی ترین تشخیص هدف و بیشترین کاهش جذب را ارائه کرد. برای ارزیابی میزان پوشش، سه گزینه (۲٫۳، ۱٫۵، و ۰٫۷ pmol µL-1) مورد آزمایش قرار گرفت که از این میان، ۲٫۳ pmol µL-1 کارآمدترین و برای حسگر انتخاب شد.
پایداری طولانی مدت نیز با نگهداری ssRNA3-AuNPs در دمای ۴ درجه سانتیگراد به مدت پنج ماه قبل از استفاده ارزیابی شد. پس از ذخیره‌سازی، عملکرد آنها مشابه عملکرد نانوذرات طلا تازه آماده شده بود. این نتایج نشان می‌دهد که ssRNA3-AuNP پایداری طولانی‌مدت بالایی دارد که قابلیت حمل حسگر را نیز افزایش می‌دهد.
مناسب ترین غلظت نانوذرات طلا ارزیابی شد و سه غلظت ۱۲، ۲۳ و ۴۷ نانومولار بررسی شد که غلظت ۴/۲۳ نانومولار بیشترین کاهش جذب و تغییر رنگ را نشان داد. بنابراین، این غلظت نانوذرات طلا برای حسگر انتخاب شد.
سرعت تشخیص و ویژگی حسگر نیز با استفاده از هدف Orf1ab مورد ارزیابی قرار گرفت که منجر به تجمع نانوذرات طلا با تغییرات طیفی قابل تشخیص بصری در عرض دو دقیقه شد. این موضوع نشان می‌دهد که حسگر RNA ویروس را به سرعت تشخیص می دهد.
یافته‌های این مطالعه نشان داد که حسگر زیستی CASCADE یک دستگاه سریع، همه‌کاره و قابل حمل است که می‌تواند برای تشخیص موثر RNA ویروس کرونا با چشم غیر مسلح در نمونه‌های بالینی با قابلیت اطمینان و حساسیت بالا مورد استفاده قرار گیرد.